ヒトiPS細胞からRPE

http://researchmap.jp/jo9e9uja4-1776138/#_1776138

http://www.stemcellstm.com/content/early/2012/02/05/sctm.2011-0057.abstract

1因子(Oct4)と低分子化合物で誘導したヒトiPS細胞からRPE細胞を誘導。
網膜変性モデルラットへの移植により、移植後18週まで網膜変性を抑制。
少なくとも移植後15か月は腫瘍形成を起こすことなく眼内で適切な位置に生着。

—————-

ClinicalTrials.gov    いろいろな治験が登録されている

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22281388
ヒトES細胞 MA09 cellを3 passage継代。
Embryoid bodyを形成した段階でRPE patchをゴラゲナーゼで単離。
Passage 2で凍結し、これを解凍したものを移植に用いた。
2009年の論文で、NIH III immune-nude mice, dystrophic RCS rats, ELOVL4 miceに移植している。
(Figure 1)
(A) 6-well plateに培養されたembryoid body。ここからpigmented patches of RPEを取り出す。
(B)培養3週目のRPE。敷石状に1層を形成しており、pigmentもある。
(C, D)解凍後、一晩培養したRPEをMITF(赤)とPax&(緑)で染色。DAPI(青)
(E, F)解凍後、3週間培養したRPEをBestrophin(赤),Pax6(緑)で染色。
(G, H) 解凍後、3週間培養したRPEをZO-1(緑)で染色。
(I)解凍直後のRPEのqPCR。Reference RPE lotは、本文中(supplementary webappendixにも)に記載は見つからなかったが、おそらく、本物のヒトRPE。
(J)RPEのphagocytosis機能評価。
pHrodoTM e coli fluorescent bioparticles(Invitrogen)を加えて16-20時間、37℃で培養。
このbioparticleは、RPEに食べられてphagosomeに入って酸性条件下になると、光る。
食べられずに細胞外のpH条件下では光らない。
フローサイトメトリーで光っている数を計測すると、bioparticleが食べられたかどうかが分かる。
Untreatedに関しては本文中に詳しい説明はないが、おそらく、ES細胞そのまま。
(K)解凍後のRPEのkaryotype。XX型の正常の染色体であった。
(Figure 2)
NIH III immune-nude mouseにhuman ES RPEを移植して9か月後の網膜切片。
(A)    human-ミトコンドリア抗体による染色。
(B)    human-bestrophin抗体による染色。
(C)    AとBのmerged
(D)    (E)の拡大図
(E)    顕微鏡写真
(F)    A, B, C, Eのmerged
(Figure 3)
Pigmentation level(4.8 pg/ cell と、10.4 pg/cell)の異なる2つのlotのRPEのgelatin上での培養結果。
実際の臨床試験では、4.1 pg/ cellのRPEを用いた。
(A, C, E) lighter lot (4.8 pg/cell)
(B, D, F) darker lot (10.4 pg/cell)
(A, B)培養21時間後    (C, D)浮遊細胞を除いた。    (E, F)培養3日後
(G)    lighter lotの方が、細胞増殖のスピードが速かった。
(Figure 4)Stargardt’s macular dystrophy患者の治療経過(眼底写真とOCT)
なお、視力は術眼が移植前「手動弁」が、移植12週間後に「0.025」となった。
免疫抑制剤は、以下の通り。
(1)    low dose Tacrolims        移植1週間前から移植6週後まで
(2)    mycophenolate mofetil (Cellcept)    移植1週間前から移植12週後まで内服
移植4か月後(16週後)の時点で、2名の被験者ともに、abnormal proliferation, teratoma formation, graft rejectionは認められなかった。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21896853
IOVS 52(12)8785-8790, 2011
2004年にカニクイザルES cellからRPE作製。
今回、2011年、カニクイザル皮膚からiPS細胞を作製し、そこからRPE作製。

(Figure 1)
カニクイザル(Cynommogus monkey)皮膚fibroblast
(1)4 geneをウイルス(retroviral vector, pVSV-G)でfibroblastへ挿入
(2)DAY 6でSTO feederへ。
(3)1か月後、ES cell like morphologyになる。
(H)CMK6はES細胞の写真。
(I)染色体数。42が正常。

(Figure 2)
AP染色、免疫染色と、RT-PCRによるiPS細胞の確認。

(Figure 3)
iPS細胞塊を、trypsin/collagenase IV処理して、PA6 cell feeder(standard SDIA method (ES細胞から高効率に神経組織に分化誘導する方法))上で培養することにより、RPE細胞を作製した。
Modified SDIA method : 細胞上ではなく、PA6 cell(mouse stromal cell line)の上清を用いて培養。

(neural retinal progenitorへの誘導)
iPS細胞を、SB431542とCKI-7というNodalとWntシグナリングのinhibitor下で培養。
培養開始2週間後、laminin-coated dishes上で2週間培養した(DMEM/F12 supplemented with B27 and 10 ng/mL bFGF)。
(Figure 4)
ヒトiPS細胞から作製したRPE細胞の遺伝子発現。細胞の免疫染色と、RT-PCR。

(Figure 5)
作製したRPE細胞のphagocytosisの評価。
Anti-MERTKを加えると、phagocytosisが抑制される。
HeLA細胞では、最初からphagocytosisがない。

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